Virologie

• Pockenvirus, Gelbfiebervirus , Human influenza Virus, Human immunodeficiency Virus (AIDS), Hepatitis C Virus, Kaposi's Sarcoma Herpesvirus, SARS Coronavirus (SARS), Enteroviren (e.g. Polio), Adenoviren, Norovirus, Ebolavirus, Human T Zell Leukämie Virus, Epstein-Barr Virus, Dengue Virus, Rous Sarcoma Virus

Allgemeines und Aufbau

• Nukleisäure + virale proteine, aufgebaut aus Einzelteile, keine Teilung
• Können sich nicht selber vermehren (kein Proteinbiosynthese, kein Stoffwechsel)
• Obligate intrazelluläre Parasiten, sehr klein
• Unbehüllte Viren
  • Nur Nukleokapsid: DNA/RNA (kann segmentiert sein) + Kapsid (Strukurproteine, schützt Genom) + virale Enzyme (zustäzliche Funktionen) und RNA/DNA bindende Protein
  • Verlassen Zelle durch Lyse
  • Höhere Stabilität (e.g. Norovirus, Adenovirus)
• Behüllte Viren
  • Nukleokapsid + Matrix (Protein Schicht) + Membran mit Hüllproteine
  • Hüllprotein (Beispiel des Influenza A Virus):
    • Hämagglutinin -> Eintritt in Wirtszelle
    • Neuroamidase -> Verlassen der Wirtszelle (Spaltet Glykosidverbindung der Sialinsäure)
    • Ionenkanäle
  • Budding oder Lyse
  • Weniger stabil, feuchtes Milieu, anfällig auf Detergenzien und säuren (GIT)
  • Unterschiedliche Lipophilie der Hüllen (hoch -> anfälliger auf Detergenzien)
• Alle Viren müssen mRNA herstellen
• Funktion der Viralen Enzyme:
  • Schutz/Transport des genoms
  • mRNA Produktion
  • Genom Replikation
  • Virus Aufbau
  • Schutz gegen IS
• Zyklus:
  • Wirtszelle finden und infiszieren
  • Produktion viraler Proteine
  • Produktion des viralen Genoms (Grosse Viren haben meist eigene Maschinerie)
  • Zusammenbau der Virionen für nächste Generation, oft symmetrische Anordnung identischer Proteine
  • Verlassen und finden von neuen Zellen
  • Strategien gegen IS
• Unterschiedliche Kapsid Formen (Helix, Kubisch, Stab, Konisch, ...)
  • Oft aus gleichen/mehrere untereinheit aufgebaut
  • Nicht-kovalent (oft WWB, SB, Hydrophbe WW, VdWK) -> Kapsel muss sich innerhalb Zelle schnell auflösen
  • Ausserhalb der Wirtzelle ist hohe Stabilität erfordert
  • Setzt sich oft von alleine zusammen
  • Bei behüllten Viren Struktur von aussen oft nicht erkennbar
• Genom (RNA oder DNA), Baltimore Klassen (wie bidlet das Virus die mRNA):
  • Class I: dsDNA
  • Class II: ssDNA
  • Class III: dsRNA
  • Class IV: ssRNA+
  • Class V: ssRNA-
  • Class VI: ssRNA+ Retrovirus
  • Class VII: dsDNA Retrovirus
  • Zusätzlich circulär oder linear
  • Allgemein: mehr RNA-Viren
• Taxonomie dank unterschiedlichen Kriterien in Ordnung/Familie/Subfamilie/Genus/Species/Variante
• Subtype mittels serotyp
• Diagnostik:
  • Direkter Nachweis: Antigennachweis, Zytopathogene Effekt, Virusgenom
  • Indirekter nachweis: Antikörpernachweis, Zelluläre Immunantwort
  • Isolierung und Anzüchten des Virus
• Subvirale elemente: Prionen, Satelliten, Viroid
• Bakteriophagen: Viren für Bakterien
  • Problem der Phagen-kodierten Toxine bei Bakterien (Diphterie, Cholera, pyrogen Streptokokken)
  • Forschung, Gentech, Therapien, Epidemiologie

Adsorption, Eintritt, Uncoating

• Viruseintritt:
  • Beeinflusst Tropismus, Angriffspunkt für Therapie und Impfstoffe
  • Protein zum Andocken benötigt
    • Behüllte: Glykoprotein (Hüllprotein)
      • Hüllprotein verankert mit Kapsid
      • Oft Oligomere mit Fusionspeptid
    • Nackte: Kapsid
      • Oberflächenstrukuren oder Fibern
    • Entsprechender Rezeptor auf Wirt (oft mehr als ein Rezeptor, auch verstärkung der Bindung)
    • Kann antigen sein
    • Bindung an "Entry Rezeptor" oder an unspezifischem Faktor
    • Mechanismen des Eintritt:
      • Konformationsveränderung am Viruspartikel
      • Aktivierung von Signalwege
        • Fusion
        • Endozytose
    • Hämagglutin bei Influenzaviren -> Sialinsäure (wird von viellen Zellen exprimiert α2-6 in obere Atemwege (Human, Schwein), α2-3 in untere Atemwege (Schwein,Vogel))
      • Hämagglutinations-Tests mittels Ery -> Quervernetzung -> Auflösen des roten Punktes, auch zum Nachweis von AK gegen Hämaglutinin einsetzbar
  • Fusion: überwinden der ZM notwendig
    • Behüllte Viren: Membranfusion mittels Fusionspeptid (mechanisch), zwei Möglichkeiten:
      • Direkte (e.g. HIV): Problem Hüllproteine bleiben auf Aussenfläche (IS!), Corticales Aktin erschwert Mobilität
      • Erst nach Endozytose (e.g. Influenza): Fusion wird anschliesslich durch tiefen pH getriggert, muss Abbau in Endosom Entkommen
        • Endozytose über unterschiedliche Pathways
    • Nackte Viren: schwierige, wenig bekannt, evtl hydrophobe Virus Regionen, Pore?
  • Intrazellulärer Transport und Uncoating:
    • Evtl. noch Transport in Zellkern (möglichst rasch), unterschiedlich Strategien
      • Freie Diffusion nur bei kleinen Viren
      • Grössere Viren benutzen oft das Zytoskelett (Aktinfilamente, Mikrotubuli)
    • Meist Uncoating an Zellkernmembran

Genom Replikation, Assembly, Budding

• Zwei zusätzliche Wege der Viren:
  • Reverse Transkriptase (DNA -> RNA)
  • RNA-Polymerase (RNA -> RNA)
  • Viren kodieren teilweise auch andere Polymerasen selber (vorallem bei Viren die in Zytoplasma replizieren)
• Produktion der mRNA:
  • Class I: dsDNA -> mRNA
  • Class II: ssDNA -> dsDNA -> mRNA
  • Class III: dsRNA -> mRNA
  • Class IV: ssRNA+ -> ssRNA- -> mRNA (ssRNA+ kann auch direkt als mRNA verwendet werden -> DNA alleine kann bereits infektiös sein)
  • Class V: ssRNA- -> mRNA
  • Class VI: ssRNA+ -> dsDNA -> mRNA
  • Class VII: dsDNA -> ssRNA+ -> dsDNA -> mRNA
• Virale Enzyme oft Angriffspunkt von Therapie (reverse Transkrptase Inhibitor bei HIV, DNA Polymerase inhibitor bei Herpes (Acyclovir))
• Vorteil von RNA-Viren: oft Keine Primer benötigt
• Nachteil von RNA-Viren: Nicht die gleichen Kontrollelemente wie Zelle -> Regulation wichtig!, kein Proofreading
• Zelluläre mRNA hat 5'cap und ist polyadenyliert
  • Capping:
    • Intiation, Schutz vor Exonuklease, Splicing
    • Viren können zelluläre Capping Enzyme benutzen, das Cap stehlen, ein zusätzliches Enzym zur Initiation bereitstellen (IRES), oder andere eigen Enzyme verwenden
  • Polyadenylierung
    • Virus: OligoU Sequenzen im Template, oder nach Transkription polyadenylierung
• Genetische Information der Viren
  • einige kb bis hunderte
• Viren sind an die Zelluläre Mechanismen angepasst (grosse unterschiede zu Bakteriophagen)
  • Eukaryotische mRNA sind monocistronisch (kodieren für nur ein Protein)
  • Viren müssen aber Platz sparen -> bicistronische RNA (versch. Anordnungen, überlappen) oder Splicing (benötigt zusätzlicher Export aus ZK)
• Manche Viren schalten Proteinsynthese des Wirtes ab
  • Spaltung des Eukaryontische IF, ersatz durch IRES
  • Dephosphorylierung von eIF4E
  • Cap-Snatching
  • Überschuss an viraler mRNA
• Genomreplikation:
  • Möglichkeiten: RNA <-> RNA, RNA <-> DNA (retrovirus), DNA <-> DNA
  • Im Zellkern oder im Zytoplasma
  • Priming benötigt (wird nicht repliziert)
    • Zirkukäre Genome
    • Hairpins
    • Proteinprimer
    • Einbau in Wirtszelle
  • DNA-Viren müssen Zelle in S-Phase zwingen oder selber Replikation bewerkstelligen (beides braucht zusätzliche Enzyme)
  • Eigener Synthese-Apparat nur bei Viren mit Grossem Genom (e.g. Pockenvirus), anfällig auf Antivirale Therapie
• Genetische Variation
  • Andauernde Veränderungen -> Selektion
  • Mutationen durch Transition, Transversion, Insertion oder Deletion
  • RNA-Viren haben höhere Fehlerrate (selten Proofreading)
  • Virus diversität nimmt mit Zeit zu innerhalb Wirt
  • Rekombination zweier viren möglich (nur intrazellulär, vorallem bei Superinfektionen einer Wirtszelle)
    • Erhöht Mutationsrate -> Gefahr bei Mischen von Viren in einem Wirt) -> Neue Viren können entstehen "antigenic shift" (wichtig bei Influenza)
• Assembly
  • Kompenenten in unterschiedlichen Kompartimente -> Programm für molekulares Sorting benötigt
  • Stöchiometre und Geometrie muss stimmen
  • Kann an verschidenen Orten stattfinden, auch mehrstufig (zb Herpes)
  • Bildung des Kapsid:
    • Proteine werde gleich an Genom angelagert
    • Kubisch: erst Bildung des Prokapsid, dann Einbau von Genom und Maturation (Protease-Hemmer)
      • Helferproteine: Provisorische Gerüst Proteine und Portalproteine
• Freisetzung
  • Nackte-Viren: Lyse oder Autophagy
  • Behüllte-Viren: Budding von Zellmembran oder Transport in Vesikeln
    • Herpesvirus bekommt Hülle an Golgi, dann in weiter in Vesikel
    • Influeza/HIV bekommen Hülle bei Austritt
    • 4 Budding Typen:
      • Hüllproteine und Kapsid notwendig
      • Capsid oder Matrix Proteine verursachen Budding
      • Hüllproteine verursachen Budding
      • Matrix Proteine zusammen mit anderen Strukturen
• Rivers Postulate als angepasste Koch'sche Postulate für Viren
  • 1 Isolation vom infiszierten
  • 2 Kultivieren in Wirtszellen
  • 3 Beweis der Filtrierbarkeit
  • 4 Induktion einer vergleichbaren Krankheit
  • 5 Re-Isolation
  • 6 Nachweis einer spezifische IA
  • Manche Viren lassen sich nicht in-vitro züchten (HCV,HBV, Papillomavirus) -> Molekular diagnostische Definition
• Genotyp (Gen!), Serotyp (AK-Antwort), Phenotyp (Viruseigenschaften)
  • Genotyp kann medizinisch wichtig sein -> Therapie/Prognose
  • HCV hat hohe Diversität -> Einfluss auf Interferon-Behandlung (2/3), Resistenzen gegenüber Protease-Hemmer (1a/b), Leberfibrose (3)
• Tropismus
  • Abhängig von Rezeptoren (susceptible, e.g. Sialinsäure), Zelluläre Funktionen (permissiv), Zugänglichkeit der Zelle
  • E.g.: Pantrop, Enterotrop, Neurotrop
  • Cellulär, Gewebe, Wirt
  • Bestimmt auch Pathogenität
  • Andere Faktoren: Temperatur, pH, Anatomische Barrieren, Immunität
• Virulenz abhängig von Virus, Wirt, Dosis, Infektionsweg
  • Replikation
  • Modulation der Wirtsabwehr
  • Virusverbreitung
  • Toxizität
• Virusausbreitung im Körper
  • Kann Virus Eptihel durchbrechen -> kann es systemisch werden
  • Lokale Infektion: bleibt an Eintrittspforte, Zell-Zell-Verbreitung, (Papillomavirus, Rhinovirus)
  • Transmission: Frei (extrazellulär), direkt (von Zelle zu Zelle), beides (betrifft die meisten Viren)
  • Generalisierte Indektion: Verbreitung über Lymph/Blut -> Virämie (Primär/Sekundär, plasma/zellassoziert)
    • Viren in Blutzellen: Monozyten (Dengue, Influenza, Masernvirus, HIV), B-LZ (Epstein-Barr), T-LZ (HIV,Herpesviren)
  • Spezialfälle: Neuronal, Blut-Liquor Schranke, Vertikale (Mutter-Kind)
• Shedding (Freisetzung)
  • Respiratorisch, Körperflüssigkeiten (Speichel,Sekrete)
  • Virusinfektionen können auch latente Formen annehmen (Integration in WirtsDNA oder Episomal (wie Plasmid), e.g. VZV und HSV)
• Pathogenese:
  • Zytopatische Effekte: Lyse, Syncytium Bildung (Hüllproteine)
    • Induktion oder Hemmung von Apoptose können beide Strategien sein
    • Induktion von Nekrose
  • Immunsystem -> kiann Diagnose erschweren
  • Onkogenese

Immunität und Immunevasion

• Natürliche Abwehr:
  • PPR (Pattern recognition receptor, TLR,RLR,NLR,CLR) erkennen PAMPS (pathogen-associated molecular patterns)
    • Viren haben Strategien entwickelt um PPR zu entkommen
  • Virusinfektion bewirkt Veränderung in Zellen -> können erkannt werden
    • Rezeptor-Bindung, Uncoating, Trasnlation, Stress
  • Interferone und proinflammatorische Zytokine (-> Leukozyten) werden ausgeschüttet
    • Kann auch Diagnostisch benutzt werden
    • 3 Typen von Interferone:
      • Typ I: IFN-α und -β, wird von infiszierten Zellen produziert, löst antiviraler Status aus
      • Typ II: IFN-γ, NK unt T Zellen
      • Typ III: IFN-λ, ähnlich wir Typ I
      • Kann Therapeutisch eingesetzt werden (systemisch oder lokal)
      • Viren können IFN hemmen:
        • Blockade der Synthese
        • Rezeptor-Decoy
        • Blockade des IFN signaling
        • Blockade von induzierten Proteine
  • Antiviraler Status: Zelle ist vorbereitet auf viralen Infekte, bei Infektion viel schnellere Apoptose
    • Ganz unterscheidliche Mechanismen
    • Induktion MHC I/II
    • Inhibition des Zellwachstums
    • Kann auch in den Viruslebenszyklus eingreifen (verhindert zum Beispiel das Freikommen von der Zelle)
  • Komplementsystem wird über 3 Wege aktiviert
    • Viren blockieren Komplementsystem
  • miRNA sind kleine nicht kodierende RNA
    • Posttranskriptionelle Regelung (passende mRNA wird inhibiert)
    • Virale (positiv) und zelluläre (negativ) miRNA die auf Viruslebenszyklus wirken
  • NK-Zellen
    • Können Zellen direkt töten
    • Hemmen Virus Replikation
    • Durch AK oder ander mechanismen (zum Beispiel Zellen die kein MHC-I haben) aktiviert
    • Viren haben unterschiedliche Mechanismen dagegen entwickelt:
      • Viraler MHC-I homolog
      • Hemmt NK aktivierende Zytokine oder Ligande
• Spezifische Immunabwehr
  • Diagnostic -> Serologie
  • Antiviraler Aktivität von AK:
    • Abfangen von freien Viren -> Verhindern infiszierung
      • Hüllproteine mutieren schnell
      • Kann auch Infektion fördern -> Aufnahme durch Makrophagen (e.g. Dengue)
    • Complement Lyse
    • Opsonization von infiszierten Zellen
      • Virus: Mutationen, Hemmung von T-Zellen, Sequestrierung (in Gewebe mit schwierigem Zugang, e.g. Gehirn)
      • HIV: Latente Infektion, MHC-I Hemmung, CTL werden getötet oder gehemmt, Erschöpfung der HIV-Spezifischen CTL

Übertragung, Impfstoffe, Medikamente

• Übertragung:
  • Respiratorisch (aerosol), Speichel (tröpfchen), Blut, Venereal (sex), Fecal-oral
  • Zoonose: Mensch als Zwischenwirt/Endwirt/Fehlwirt, mit ohne direkte menschliche Übertragung
• Aerosol/Tröpfchen
  • Häufigster übertragungsmechansimus
  • Nicht alle Viren überleben Aerosol
  • Grössere Tröpfchen sedimentieren rasch
  • Aerosol: Aerogen, Virus muss bis zum einem gewissen Grade gegenüber Austrocknung resistent sein (Influenza, Masern)
    • Kommt vorallem aus tieferen Respiratorischem trakt, können auch tiefer eindringen bei Empfänger
    • Bei Influenza: gefördert durch niederige Luftfeuchtigkeit und Kälte -> Winter
  • Iatrogen (durch Behandlung verursacht) und nosokomial (in Spital erworben)
  • Vektoren
    • Lebend: Mosquito (Gelbfieber, Dengue), Zecken (FSME)
    • Artifizielle: Nadelstiche/Transfusionen (HIV, HBV)
  • Transplantationen
• Impfstoffe
  • Pockenvirus ist ausgerottet!
  • Möglich wäre auch Poliovirus, Masernvirus, Mumpsvirus und Rubellavirus
    • Basic reproduktiv rate muss unterhalb von 1.0, wird durch Impfung/Isolation gesenkt
    • Masern: R0 = 12-18 -> Impfrate von 83-94% gefordert
    • Nur möglich falls keine komplexen tierischen Reservoir
  • Impfplan Empfehlung des BAG
  • Aktive Impfstoffe:
    • Lebende oder attenuirte Impfstoffe
      • Attenuirte Viren werden auf anderem Wirt selektioniert bis sie für Mensch nur noch schwach pathogen sind (Polio, Masern)
      • Auch molekularbiologisch möglich (Influenza)
    • Totimpstoffe
      • Nachteile: Virus repliziert sich nicht mehr und erzeugt nur schwache Immunantwort -> Mehrmals impfen
    • Subeinheiten, Proteine oder DNA
      • Proteine/Peptide: schwache Immunantwort -> Adjuvantien stimulieren IA
        • Säsonale Grippeimpfung: Selektion des aktivisten genotyp in Südostasien -> Bebrütten von Eier -> Extraktion und Reinigen des Impfstoffs
      • Virus-like-Partikel: Genom wurde entfernt
      • DNA Vektoren die Virale Proteine exprimieren (bis Heute hauptsächlich Veterinärmedizin)
      • Viraler Vecktor die Proteine exprimiere
        • Auch in Gentherapie
        • Problem der Sicherheit, wo findet die Integration in das menschliche genom statt?
    • Virale Vektoren (Harmlose Viren die Proteine von Erreger produzieren)
  • Passive Impfung: nur AK werden übertragen (geschieht auch von Mutter zu Kind)
    • ZMapp: Cokctail von 3 AK gegen Ebola
  • Impfstoffe unterschiedlich Wirksam
• Antivirale Medikamente:
  • Mechanismen:
    • Greift virale Proteine an
      • Neuroaminidase Inhibitor blockiert freikommen von Influenza A
      • Protease Inhibitoren hemmen reifen von HCV
      • Hemmung der HIV-1 reversen Transcriptase
    • Greift zelluläre Proteine an
      • Maroviroc greift Korezeptor CCR5 an (HIV)
    • Falsches Substrat für virale Enzyme
      • Falsches Substrat für Reverse Transkriptase von HIV-1
      • Acyclovir ist kompetitiver inhibitor von HSV DNA-polymerase
  • Problem der Resistenzentwicklung

Diagnose

• Direkte Methoden
  • Antigennachweis (ELISA, Immunfluoreszenz)
  • Nachweis des viralen Genoms (PCR)
  • Mikroskopie
  • Viruskultur als Hilfe
• Indirekte Methoden
  • Antikörper in Serum (Serologie -> ELISA, Westernblot, IF)
  • Viruskultur (Nachweis von zytopathischen Effekten)
  • Immunantwort (selten)
• Quantifizierung der Viruslast -> meist PCR
• Medikamentresistenzen über Genotyp
• Qualität der Proben sehr wichtig
  • Zeitpunkt (Verläufe!), Art (Tropismus!), Menge
  • Frischheit, Transport, Lagerung
• ELISA:
  • Direkt oder indirekt (sandwich
  • Antigen capture ELISA
  • Antibody ELISA
  • Enzym das Substrat zum Fluoreszieren bringt (im Kontrast zu IF wo direkt Fluoreszenzfarbstoff)
• Westernblot: Elektrophoretische Auftrennung von sequenzen -> Fingerprint
• Virusnachweis in Zellkulturen: Monolayer, beobachtbare zytopatische Effekte (Abrunden, Zellfusion, Einschlüsse im Kern)
  • Nicht sehr spezifisch, empfänglich und permissive Zellen benötigt
  • Breites Spektrum erfassbar, sensitiv, konstengünstig
  • Zeitaufwendig, nicht alle Viren, Vitalität der Viren nach Lagerung/Transport evtl vermindert
  • HSV: Ballonierung
  • Enterovirus: Schrumpfen (pyknotisch)
  • RSV: Synzytien
  • HBV: Milchglasige Homogenisierung des Zytoplasma (Leber!)
  • Zytomegalievirus: Aufblasen
  • Herpesvirus: Homogenisierung des Zytoplasma, Kerneinschlüsse, mehrkernig
• PCR
  • Qualitativ und quantitativ
  • Detection mittels Gelelektrophorese
  • Detection mittels Sonden (wird während Replikation geschnitten und gibt Marker frei)
  • Multiplex: mehrere hypothesengleichzeitg, aber weniger sensitiv
• DNA microarrays:
  • Hybridisierung an Proben
  • Viele Hypothese gleichzeitg
• Sequenzierung
  • Wichtigste Methode -> genotyp
  • Next Generation Sequencing
• Resistenzbestimmung über Genotyp

Wichtigere Viren für Beispiele

• Herpes Simplex Virus, Adenovirus, HIV, Influenza Virus